目前我国种植的油菜主要是甘蓝型油菜。但我国最先种植的甘蓝型油菜是从日本引进的“胜利油菜”，而后从欧洲引进一些甘蓝型油菜品种，其遗传基础是比较狭窄的。我国地大物博，生态气候多种多样，经过不同育种单位的油菜育种家们不断地对甘蓝型油菜进行品种改良和引种，已培育出上千万份适应不同生态气候的高产、优质、多抗的油菜新品种，使我国甘蓝型油菜种质资源在不断扩大，已成为一个巨大的种质资源库。为此，对甘蓝型油菜的遗传多样性及遗传距离进行分析是十分必要的。马朝芝等(2003a; 2003b)、周国岭等(2004) 、王灏等(2009)、王凯华等(2011)利用SSR、ISSR、RAPD等分子标记对甘蓝型油菜的遗传多样性进行研究，揭示了不同甘蓝型油菜材料的遗传距离及其亲缘关系，但他们都没有根据遗传多样性参数评价其遗传多样性水平。仅厦国银等(2009)根据遗传多样性参数利用RAPD标记评价了云南野生油菜的遗传多样性水平。本文作者利用SSR和ISSR标记对甘蓝型油菜的遗传多样性进行研究，从而根据遗传多样性参数揭示了我国蓝型油菜的遗传多样性水平及其原因，为我国甘蓝型油菜的种质资源利用与品种改良提供了依据。

1结果与分析
1.1甘蓝型油菜的遗传多样性的SSR和ISSR分析
从40对SSR引物中筛选获得16对多态性SSR引物(表1)，每个引物扩增的DNA条带数为1~11条，多态性位点数约为1~8个，占所选用引物的40%。用这16 对多态性SSR 引物对31份参试材料DNA样品进行PCR扩增，结果(图1)共检测到146个等位位点，其中多态性位点119个，多态性比率为81.5%，每对引物约4~10个多态性位点，平均为7.4个。根据146个标记位点的信息.，采用POPGENE32软件分析，结果表明(表2)31份甘蓝型油菜的平均有效等位基因数、杂合度、Shannon指数分别为 1.4521 0.2563，0.3749，说明它们遗传多样性水平较高。
 

表1 SSR引物的扩增多态性 Table 1 Polymorphism amplified by the SSR primers used in the experiment

 

图1 引物CB10028 的扩增电泳图 Figure 1 Electrophoretic banding pattern amplified by SSR primer CB10028

 

表2 31份甘蓝型油菜的遗传多样性分析 Table 2 Genetic diversity of 31 varieties of Brassic napus analyzing by SSR and ISSR markers

从40条ISSR引物中筛选到12条多态性ISSR引物(表3)，每个引物扩增的DNA条带数为2~10条，多态性位点数约1~6个，占所选用引物的30%。用这12条多态性ISSR 引物对31份参试材料DNA样品进行PCR扩增，结果(图2)表明共检测到77个ISSR标记位点，其中多态性位点42个，多态率达54.54%，每条引物扩增的多态性位点数约1~6个，平均为3.5个。根据77个标记位点的信息，采用POPGENE32软件分析，结果表明(表2) 31份甘蓝型油菜的平均有效等位基因数、杂合度、Shannon指数分别1.4828，0.2672，0.3873，同样说明它们遗传多样性水平较高。
 

表3 所用ISSR引物的多态性扩增 Table 3 Polymorphism amplified by the ISSR primers used in the experiment

 

图2 甘蓝型油菜品种的ISSR引物807扩增 Figure 2 Electrophoretic banding pattern amplified by ISSR primer 807

1.2甘蓝型油菜品种间的遗传距离
利用NTSYSpc2.10软件分析甘蓝型油菜品种间的遗传距离。SSR揭示品种间遗传相似系数介于0.4910714~0.8839286之间，其中31号和20号的遗传相似系数最小，为0.4910714，即它们的亲缘关系最远，而16和17号间遗传相似系数最大，为0.9285714，说明湘杂油748与湘杂油613很可能具有共同的杂交亲本或杂交亲本的亲缘关系很近。而ISSR揭示品种间的遗传相似系数介于0.3571429~0.9523810之间，其中30号和31号间遗传相似系数最大，为0.9523810，说明云油杂2号与云双油2号亲缘关系最近，可能在品种选育中选用了相同的亲本，或者育种亲本的亲缘关系较近。其次，1号与2号，17号与18号，19号与20号间的遗传相似系数较大，为0.9285714，即它们的亲缘关系较近。10号与1号、2号的遗传相似系数最小，为0.3571429，即它们的亲缘关系最远。

1.3 UMPGA聚类分析
根据SSR、ISSR揭示的31份甘蓝型油菜品种间遗传相似系数，利用NTSYSpc 2.10软件构建品种间UPGMA聚类图(图3)，从图3可以看出，在遗传相似系数为0.64时，31份甘蓝型油菜，被分成4个大类群：第Ⅰ类包括1、2、3、4号品种；第Ⅱ类包括12、13、5、9、14、7、8、11号品种；第Ⅲ类包括16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31号品种；第Ⅳ类包括6，10，15号品种。而且同一地区或同一育种单位提供的品种一般聚为一类，说明它们的遗传基础相近，其育种亲本有一定的共同来源，而不同单位选育的品种其遗传背景差异较大，往往被分配到不同的类群中。但也有不同地区的某些油菜品种聚在一起。例如，湖南的湘杂油系列品种与云南花油系列品种聚在一起，可能是湘杂油系列选用了云南花油系列品种或亲缘关系较近的材料作为杂交亲本；德油杂988、湘杂油763与浙双72聚在一起，很可能是德油杂988、湘杂油763的亲本与浙双72有一定的亲缘关系；华丰油杂8号与德油杂999聚在一起，可能是它们选用了共同杂交亲本或杂交亲本有较近的亲缘关系；湘油15号和浙双758聚在一起，而湘油15号的父母本分别为湘油11号、湘油10号，浙双758的父母本分别为84004、S7，可能是其育种亲本有较近亲缘有关。这些结果说明了来自不同地区的材料却很有可能具有共同的血缘。在当前油菜育种中，种质资源的相互交流、引进、利用越来越频繁，很多种质资源公共化，对增加油菜遗传多样性水平有明显的作用，表现出基因融合、区域弱化等趋势。
  

图3 基于ISSR标记和SSR标记的遗传相似性数据的31份甘蓝型油菜品种的聚类分析 Figure 3 The dendrogram of 31 rapeseed varieties based on data of the genetic similarity coefficient generated by ISSR and SSR markers

2讨论
遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，反映了生物对环境的适应能力和对环境变迁的进化能力(厦国银, 2009; 伍宁丰等, 1997)。本研究表明31份甘蓝型油菜品种在SSR标记和ISSR标记揭示的这两种遗传组成具有相同的遗传多样性，并且遗传多样性水平较高。但对6个省份的甘蓝型油菜品种的遗传多样性进行单独分析时，发现不同省份的差异较大(未示出)，这可能与研究材料的多少、类型及材料的代表性有关。SSR与ISSR共同聚类分析表明，在遗传相似系数为0.64时，31份甘蓝型油菜，被分成4个大类群。一般同一地区或同一育种单位而来的品种聚为一类，比如云南省的花油系列、湖北省地区的油菜品种(包括中国农业科学院油料作物研究所和华中农业大学提供的)各单独聚为一类。伍宁丰等(1997)用RAPD方法对我国7省市和国外引进的总计40份甘蓝型油莱品种的遗传多样性进行了研究，从西德引进的Ledis、28620、28621、28663、1655、28670、28669聚集在一起，由胜利油菜系选得到的湘油2号、湘油3号、湘油4号和71—39、潭油3l号聚集在一起；何余堂等(2002)对我国23个省市的172份白菜型油菜资源进行了遗传多样性分析，结果来源相同的聚为一类。王璐璐(2009)选取136份贵州省白菜型油菜，利用RAPD分子标记进行遗传多样性分析，发现来源相同或相近地区的种质基本上能聚为一类。但也有不同地区的某些油菜品种聚在一起，例如湖南的湘杂油系列品种与云南花油系列品种、德油杂988、湘杂油763与浙双72、华丰油杂8号与德油杂999、湘油15号和浙双758聚在一起，说明了来自不同地区的材料却很有可能具有共同的血缘。在当前油菜育种中，种质资源的相互交流、引进、利用越来越频繁，很多种质资源公共化，对增加油菜遗传多样性水平有明显的作用，表现出基因融合、区域弱化等趋势。但Ofori等(2008)研究认为品种改良对油菜遗传多样性没有影响，不会降低其遗传多样性水平。王灏等(2009)对来自我国19个省市和国外8 个油菜主产国的104 份不同类型、不同性状的甘蓝型油菜种质资源进行了RAPD分析，研究结果表明目前甘蓝型油菜育种资源间材料的遗传关系已明显的表现出遗传多样、基因融合、区域弱化等复杂状态；王凯华等(2011)用SSR分子标记对国内外48 份甘蓝型油菜品种进行遗传多样性分析，发现划分的3 大类群间相对独立又有一定程度的渗透，说明材料之间存在不同程度的亲缘关系。

3材料与方法
3.1 材料
研究所用的油菜品种是从云南，湖北，四川，湖南等地区搜集的31份甘蓝型油菜品种(表4)，SSR引物(表5)、ISSR引物(表6)是由上海生工合成。
 

表4 31份甘蓝型油菜品种 Table 4 31 varietes of Brassic napus employed in this research

 

表5 SSR多态性引物 Table 5 SSR polymorphic primer

 

表6 ISSR 多态性引物 Table 6 ISSR polymorphic primers

3.2方法
3.2.1甘蓝型油菜的种植与取样
将31份甘蓝型油菜品种分别种植在云南农业大学后山农场，每个甘蓝型油菜品种随机取样5株，每株取1片嫩叶用于基因组DNA的提取。

3.2.2甘蓝型油菜基因组DNA的提取
甘蓝型油菜基因组的提取参照由Murray和Thompson(1980)修改而成的简便CTAB法提取叶片总DNA。将提取的同一品种DNA样品混匀，然后分装，置于4℃冰箱中保存备用。

3.2.3 SSR多态性引物的筛选
选取性状和生育期差异最大的2个品种——华油杂9号和云花油3号的DNA样品为模板，用于SSR多态性引物的筛选，其扩增体系和PCR反应程序参照(沈金雄等, 2004)。程序运行在Bio-rad PCR仪(Mycycler)上进行。然后用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

3.2.4 ISSR多态性引物的筛选
取材如同SSR多态性引物的筛选。ISSR扩增体系和热循环程序参照(沈金雄等, 2004)。程序运行在Bio-rad PCR仪(Mycycler)上进行。产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。

3.2.5 甘蓝型油菜的SSR、ISSR分析
利用筛选出的多态性引物(16对SSR引物和12条ISSR引物)，对来自云南、湖南、湖北等地的共31份甘蓝型油菜品种进行SSR、ISSR分析。其扩增体系如同多态性引物筛选的扩增体系。

3.2.6 读带与数据处理
根据DNA Marker的片段大小，对扩增结果人工统计，在同一位置的有带片段记为1，无带记为0。
 
3.2.7 软件分析
本实验数据用POPGENE32软件计算品种间的多态位点百分率(P)、有效等位基因数(Ne)，期望杂合度(H)、shannon指数(I)等数据；并利用NTSYSpc 2.10软件(Rohlf, 2000) 构建品种间基于Nei's遗传一致度的UPGMA聚类图。

作者贡献
林良斌、孙桂林本研究的实验设计和实验研究的执行人；林良斌是项目的构思者和负责人，指导实验设计，论文写作与修改；孙桂林完成实验和实验数据分析。彭少丹、汪骞、陈升位参与本研究的实验数据和结果的分析。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家863计划(2011AA10A104)和云南省财政厅专项(云南省油菜产业体系建设)资助。作者感谢湖南农业大学陈社员老师提供油菜品种，感谢华中农业大学陈磊同学帮忙收集湖北的油菜品种。感谢云南农业大学农学与生物技术学院黄丽、成晟、廖红同学在实验中的帮助。感谢云南农业大学农科基础实验中心提供帮助的诸位老师。

参考文献
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